Okazaki fragment[오카자키 단편]의 존재 증명
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작성일 21-10-25 02:39본문
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NaOH-EDTA에 의한 denatured DNA 추출: cell들은 0.01M EDTA(ethylenediamineteraacetic acid)를 함유한 얼음같이 찬 0.1N NaOH에 5X cells/ml의 농도로 고정된다된다. Okazaki 박사는 이를 E.coli 실험으로 증명하였다. cell들이 기대한 시간동안 -thymine을 통합하게 한 후에, culture를 부순 얼음과 KCN (0.02 M까지)에 붓는다. 이중 lagging strand에 형성되는 short fragment를 Okazaki fragment라고 한다. E. coli 15를 pulse label하기 위해 thymidine을 함유한 medium에서 키운 cell들을 촉진시키고 thymine을 함유하지 않은 0℃의 소량의 신선한 medium에서 재부유시킨다. culture 1ml에서 0.5~1ml의 DNA가 최종적으로 얻어진다.
Okazaki fragment[오카자키 단편]의 존재 증명
Thomas procedure에 의한 native DNA 추출: 이것은 몇가지 실험(SDS(sodium dodecyl sulfate)처리는 37℃에서, 그리고 DNA 용액은 collodion membrane을 통한 여과에 의해 모은다)외에는 이전에 설명(說明)된 것과 같이 수행한다. suspension은 간간이 유리막대로 약하게 휘저어지면서 20분 동안 37℃로 배양하며 불용성 물질은 저속의 centrifugation으로 제거한다.
다. -thymine( M)을 첨가시키면 reaction response은 KCN과 얼음에 의해 멈춘다. E. coli DNA의 80% 이상과 T4 phage에 감염된 cell들의 pulse labeled DNA 50-80% 가량이 이 과정으로 복구된다된다. Okazaki 박사는 이를 E.coli 실험으로 증명하였다.
DNA replication에서 daughter strand에서 leading strand는 연속으로, lagging strand는 short fragment를 형성하면서 불연속적으로 합성된다. cell suspension은 20℃의 더 많은 양의 stirred medium에 붓는다. E. coli 15로는, 회복이 30~60%로 다양하지만 병행된 실험에서 pulse labeled DNA와 uniformly labeled DNA간의 구조적 차이는 발견되지 않았다. 그리고 cell들은 0℃에서 centrifuge하여 모은다.
hymine이 불필요한 박테리아나 T4 phage에 감염된 cell을 pulse label하기 위해 -thymine (14 mc/μmole)을 20℃(B. subtilis는 30℃)의 stirred culture(5 X 108 cells/ml)에 넣어 M이 되게 한다.
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DNA 변성: native 상태에서 추출된 DNA는 20분 동안 실온에서 1mM의 EDTA를 포함한 0.1N NaOH에서 배양되면서 변성된다된다.
설명
DNA replication에서 daughter strand에서 leading strand는 연속으로, lagging strand는 short fragment를 형성하면서 불연속적으로 합성된다 이중 lagging strand에 형성되는 short fragment를 Okazaki fragment라고 한다.